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植物愈伤组织培养

当前位置: 中国苗木网 > 栽培技术 >
来源:未知 作者:admin 发布时间:2013-07-31 13:35

        一、原理 
        植物组织培养是指在无菌条件下,对离体植物组织(器官或细胞)分离并在培养基中培养,使其能够继续生长,甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性,即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组,因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞,一旦脱离原有的机体环境,成为离体状态,在适宜的营养和外界条件下,就会表现出全能性,从已经分化定型的细胞,脱分化,成为恢复分裂能力的细胞,并能重新生长发育成完整的植株。
愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞,通过脱分化不断分裂、增生子细胞,这些细胞胞分裂快,结构疏松,颜色浅而透明,逐渐形成了无序结构的一团细胞。 
        二、试剂及仪器 
        (一)仪器设备 
        超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器(1-5ml)、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶(500ml、100ml)、量筒、烧杯(1000ml)、试剂瓶(1000ml、100ml)、长镊子、记号笔(或标签纸)、培养皿、酒精灯、打孔器  999中国苗木网,www.999miaomu.com
        (二)试剂 
        75% 酒精、次氯酸钠(或H2O2)、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、烟酸、盐酸-硫胺素(VB1)、盐酸-吡哆醇(VB6)、肌醇、甘氨酸 
        三、实验步骤 
        (一) 培养基配制 
        1. 培养基的选择 
        植物组织培养中应用的培养基,一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。 
        无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素:C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等,微量元素:Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。 维生素中只有硫胺素是必需的,而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA (吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、 NAA(萘乙酸)、NOA(萘氧乙酸)、 P-CPA(对氯苯氧乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸);BA P(苄氨基嘌呤)、6-BA(苄基腺嘌呤)、2-Zi(异戊烯氨基嘌呤)、 KT(激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等,可促进分化,但如培养基配方适当,则大多数组织是不需要的。 

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        培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育,故应根据培养植物的种类和部位,选择适宜的培养基。培养基种类繁多,最基本、最常用的培养基为MS培养基(见表1)。 
        2. 培养基的配制 
        ① 先按表1配制MS培养基贮液,②再将贮液与其他成分按比例混合。③ 此外还需加入适量的蔗糖作为碳源,起支持作用的琼脂粉,适量的生长调节剂等。④ 将上述培养基加热溶解后,加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤ 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 调节培养基的pH值至最适。⑥ 分装至三角烧瓶,封口膜封口,等待灭菌后使用。 
        3. 几种诱导愈伤组织的培养基 
        胡萝卜MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 
        玫瑰叶盘,芽 MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 
        烟草叶盘、叶柄 MS+0.1mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA 

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        pH 5.8,蔗糖30%,琼脂粉6.5g/L。 
        (二)灭菌 
        1.培养基及器具灭菌培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度,常用的灭菌温度为121℃,所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化(见表2)灭菌结束后待温度下降到50℃以下,才能取出已灭菌的培养基。 
        可用同样方法对器具同时进行灭菌,包括:培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。 
        2.工作环境灭菌 
        接种前1h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后,先关掉棚面的紫外灯,再打开风机,最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时,要先打开台面的紫外灯,再关风机,最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。 
        3 . 植物材料的灭菌 
        植株各部分的表面携带着各种微生物,他们是植物组培的污染源,所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒;组织内部侵染的真菌或细菌很难消除,这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢,再用无菌洁净滤纸吸干水分。 
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        植物材料的灭菌需在超净工作台内进行,可选择不同的灭菌剂进行植物组织表面消毒(见表3)。同时注意,表面消毒剂对植物组织也是有毒的。因此,应当选择消毒剂的浓度和时间,尽量减少组织的死亡。灭菌后,需用无菌水反复冲洗,彻底洗去表面消毒剂。
如:胡萝卜储藏根消毒:将胡萝卜用洗涤灵清洗,擦干,切段。进超净工作台后,先用75%酒精擦洗切段,擦干后,在2%次氯酸钠中浸泡5秒钟,用无菌水冲洗10 次,无菌滤纸吸干,用灭过菌的打孔器取材。准备工作就绪后,可以进行接种。 
        (三)接种 
        1. 进台 
        工作人员进入接种室前,需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、手腕,再擦培养基瓶和超净工作台。 
        2. 接种 
        (1) 剪、镊消毒:接种前剪、镊应插入75%酒精瓶中,取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧,灼烧时应将剪口、镊口张开,烧至剪、镊上火焰熄灭为止,冷却后方可进行接种。接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时剪口并拢,不可接触磨口瓶和其它器皿,并保持尖端向下。  中国苗木网,www.999miaomu.com
        (2) 插植外植体:左手拿三角瓶,解开封口膜,将三角瓶几乎水平拿着,靠近酒精灯焰,将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟,使瓶口的水气散发掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基上,镊子灼烧后放回磨口瓶,再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒,灼燎时应旋转,避免烧坏,盖好封口膜,扎紧皮筋,便完成了第一瓶的操作,接着再做第二瓶,如此直到外植体全部接完。 
        3 注意事项 
        (1) 操作人员的头、胳膊等不得进入台内; 
        (2) 操作人员不得随意谈话、说笑,以免造成污染; 
        (3) 用酒精对双手消毒时,务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰,以免火焰伤手; 
        (4) 台外人员走动要轻、动作要小。 
        (四) 培养 
        接种或继代培养的植物组织置于人工气候箱中培养,温度25±2℃,适当光照强度和光周期。每4-6周继代一次。培养过程如果有的培养物被微生物污染,应当马上将其清理,以免影响其它培养物。 (记者 佚名) 999中国苗木网,999miaomu.com

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