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月季生物技术进展

来源：未知作者：admin 发布时间：2013-07-28 15:59

现代生物技术特别是转基因技术有效缩短了育种时间，克服了一些农艺学的问题和环境问题，这些问题通过传统的方法无法解决。利用生物技术的方法，如通过组织培养扩大月季繁殖，通过体细胞无性系的变异及遗传物质的转化，丰富月季的染色体组，本文就这方面的问题进行了综述。

一、引言

植物组织培养技术在园艺上的第一个有效利用是1920年在实验室条件下诱导兰花种子萌发。植物组织培养在栽培植物的大面积商业应用出现在30年前。与草本植物相比，木本植物仅有150多个应用比较广泛的种类被成功扩繁。月季作为商业切花作物之一，常常通过芽接的方法进行繁殖。月季的育种目标是提高各项生物学特性以增强其观赏价值，包括花的颜色、大小、形状、开花持续时间及对环境的适合性。尽管理想的特性被经典育种所采用，但仍有一些因素限制了这一方法。

首先是基因库的限制；第二是不亲和性染色体倍性的差异限制了远缘杂交；第三，某些特性如生长的均匀性和开花是受多基因控制的。各种因素巧妙的平衡决定了植物的生长和发育。这种平衡将被有性杂交和筛选所改变。可以设法用农杆菌介导的方法和其它生物技术方法来建立转化体系。细胞生物学和分子生物学的发展为开发新的种质资源提供了机会，这种种质资源可以满足变异的需要。

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月季基因工程战略是有价值的，因为它促进了单个基因的改变而不会破坏原有的特性所表现的商业价值。转基因在月季方面的应用有很大的潜力。可以提高抗病虫能力，改善花色、形态结构和瓶插寿命。月季野生种和栽培种的鉴定可以通过各种分子标记（RLFP和RAPD）和同工酶技术进行。月季扩繁方面的广泛研究使我们对扩繁有了一个全新的认识，近年来生物技术的应用给月季研究的各方面提供了有利条件。

二、月季育种蔷薇属是一个非常大的家族，确切的种类和数目目前还不清楚，我们现在的月季已经经过了几个世纪的人工杂交和自然变异的历史过程。大部分栽培月季分布在北半球的温带，亚洲是其基因中心，大多数的种在亚洲被发现。月季的染色体数目从2n=2X=14到2 n=8X=56，大多数是二倍体或是四倍体，商业性种植的栽培通常是三倍体或四倍体。育种家对月季突变表现出很大的兴趣，频繁发生的自然突变加大了遗传物质的变化。

Jacobs等1970年报告了离体技术在突变体的繁殖方面的应用。从 1937年到1976年，发现865种月季是通过自然突变产生的，289种具有攀缘性。月季类别不同突变频率也不同。因此，研究突变基因的遗传很有意义。已经发表的月季突变育种方面的文章很多，James（1983 ）报告了两个诱导突变体，波拉（Paula）来自栽培品种伊丽莎白皇后（Queen Elizabeth），粉红帽子（Pink Hat）来自不知名的蔷薇。它们是通过γ射线照射正在生长的顶芽而获得的。Ｂｅｎｅｔｋａ于１９８５年分别用０、２０、３０、４０和６０ＧＹγ射线照射切下的单芽，观察了４代，他发现４０－５０ＧＹ是最佳处理。Ｗａｌｔｈｅｒ和Ｓａｕｅｒ（１９８６）用离体技术，通过用Ｘ射线处理来增加植物的变异性。 999苗木网,999miaomu.com

三、无菌培养的建立

对离体培养来说，弄清植物的生理状态及对不同病原菌的敏感性是非常必要的。通常大多数外植体要用5-10%的去垢剂溶液洗20分钟，也可用0.1%HgCl2 杀菌20-25分钟，接着用蒸馏水冲洗2-5次，再转到M S（Murashige and Skoog 1962）培养基上或木本植物培养基（Loyd and Macown 1981）或B5培养基（Gamgorg et al 1968），再补充不同浓度的生长调节剂。最初的外植体必须先用20%的酒精处理20-30 秒，接着用0.1%HgCl2处理，然后用无菌蒸馏水冲洗。在某些情况下，刚开始培养几个月后，从外植体切口末端会分泌出乳白色的内部污染物。

四、防止培养基氧化当外植体在培养基上培养时，会出现两个主要问题，其中之一是褐变，它被认为是从外植体切口处流出的多酚氧化酶被氧化的结果，褐变可以通过加入诸如PVP（聚乙稀吡咯）、柠檬酸或抗坏血酸阻止氧化而克服，也可以接种后在黑暗中培养1-2天，因为人们发现光能影响多酚氧化酶的活性。在大多数情况下，每6-7天要把外植体转移到新鲜培养基上，通过反复的再培养，褐变问题就能解决。

五、增殖方法

Mar和Zieslin（1987）论述了生长调节剂在月季增殖方面的作用，每一个顶端或叶腋的分生组织都有发育成具有自然分枝系统的主枝的能力，并且具有无限增殖的潜能。不定芽是特定的愈伤组织细胞发育产生的。愈伤组织是修剪或受伤引起的伤害反应。 999苗木网,www.999miaomu.com

１．分生组织培养

2.愈伤组织培养和植株再生

3.花药培养

4.原生质体培养

5.花粉培养

6.悬浮培养

六、根的发育

在离体下，由正常生长的幼芽成功进行根的诱导，究竟是直接在综合培养基上进行，还是在去掉CTK的培养基上进行，取决于种和品种，生根能力还取决于内部物质的互相作用及外部因素。Skirvin和Chu(1 979)在不加生长调节剂的固体培养基上用月季的再生幼芽诱导生根。许多学者报告在外加低浓度生长素（IAA或IBA或NAA）0.1-0.5毫克/升范围内，并降低蔗糖浓度可以很容易地从切下的成熟幼芽上诱导生根。 Savies（1980）在几个栽培品种的月季上用外加40g/L蔗糖，不加生长调节剂的MS培养基上生根，成熟率达100%，Khosh-Khui和Sink（19 82）报告了不同浓度的生长素混合物，在不同温度和光照下对月季婚礼粉生根的影响，他们认为，IAA（0.0-0.1毫克/升）和NAA(0.0-0.1 毫克/升)对诱导生根是有效的，不同浓度的盐、生长素、庶糖、琼脂及pH值和不同光周期对月季根发育的影响已经有了大量的研究，但培养环境如温度和光照对生根影响方面的报告很少。

Khosh-Khai和Sink(1982b.c)在大约1.0klax光照度下使80%的婚礼粉成功生根，他们观察到高光照度(3.0klax)会抑制生根，另一方面，他们注意到培养箱中，不论光照度为多少，培养瓶阴凉的低位部分微小幼芽的生根最好。Bresson等（1982）报告每天12-24小时17mmol / m2.s的光通量密度对开始生根是最适宜的。 999中国苗木网,www.999miaomu.com

Skirvin和chu（1984）和Skirvin等（1984）发现红光对微型月季的生根有利，他们还用离体的杂种月季增辉（Improved Blaze）已经发育的幼芽，通过降低MS培养基的盐浓度（6.0-7.5毫米）成功诱导生根。把幼芽末端在1毫米IAA的溶液中浸几个小时，以代替含有生长素的培养基，也能成功诱导生根。

Khosh-Khui和Sink（1982）报告1/2MS培养基外加NAA（0.54微摩尔/升）可以使杂种月季新娘的面纱（Brida Veil）诱导生根。Sauer 等（1985）报告10个不同品种的月季在1/3浓度的MS培养基上外加5.7 微摩尔/升的IAA，在10-14天内生根。随后，Douglas等（1989）用伊丽莎白皇后幼芽（大于2mm）在稀释到1/4浓度的MS培养基上，在没有生长调节剂的情况下成功获得了非常高的生根率。

Rout等（1990）报告了7个不同的月季品种在1/2MS培养基上外加 0.1-0.25毫克/升NAA或2，4-D或二者混合物，8-10天内的生根情况，涉及的杂种月季品种有兰道尔（Landorn）、伊丽莎白皇后，处女座（ Virgo），超级巨星（Super star）、海珍珠（Sea pearl）、幸福（Happiness），其生根率分别为90.9%、87.5%、92.0%、99.2%、86.2 %和83.9%。经过8-10天的培养，微小幼芽的生根在固体培养基中比在液体培养基中好，生根与微小幼芽的芽龄和大小有关。Rount比较了3 个处理对6个杂种月季品种的生根反应，幼芽长度和芽龄分别为0.5-1 .0厘米4周、1.5-2.0厘米6周、2.0-2.5厘米8周。生根率最高的（92 -98%）是6周龄1.5-2.0厘米长的幼芽，放在IBA（1.0毫克/升）的溶液中浸15-20分钟后在无菌营养基上培养。Amold等（1995）报告用朝鲜月季约翰富兰克林(John Franklin)和冠军（Champlain）的幼芽在低浓度或缺少生长素及高盐浓度的培养基上生根良好，冠军生根最适宜的条件是在高IAA浓度下，降低盐浓度和IBA及NAA浓度。月季和平的离体幼芽在外加0.5毫克/升IBA的1/2MS的培养基上生根良好。苗木网,www.999miaomu.com

七、体细胞的胚体形成在离体增殖的方法中，通过体细胞的胚体形成给无性系的增殖提供了巨大潜力，因为单个的细胞能诱导产生一个胚体最后形成完整植株。许多研究人员用月季的叶子、节间、雄蕊的花丝、根和受精的胚使体细胞的胚体形成获得成功。Wit等用栽培品种多米格（Domingo）、备用钥匙（Vic key）、褐色（Brown）的叶作外植体，在1/2MS培养基上外加0.1×10-6激动素和0.05×10-6NAA培养了6-12周，观察体细胞体。Rount等（1991）报告胚体发生的诱导及其后来的发育，愈伤组织用栽培月季品种南道尔末成熟的叶和茎段产生的愈伤组织，用1/2MS培养基外加2.2微摩尔/升BA，0.05微摩尔/ 升NAA，0.3微摩尔/升GA3和200-800毫克 / 升的脯氨酸。玫瑰（Rosa Rugosa）未成熟的种子在没有生长调节剂的MS培养基上能诱导胚体的形成。DAS等（1993）观察到体细胞胚体形成的诱导依靠碳水化合物的类型和组成。体细胞胚体的最大产量在含有0.1摩尔/升果糖或蔗糖而缺乏生长调节剂的培养基上获得。Moyne等(1993)建立了与再生潜力有关的杂种月季胚体形成的细胞体系，他们还报告了在愈伤组织中，大多数细胞是4倍体。Das等（1993）观察到在诱导培养基中加入麦芽糖（20克 / 升）能提高正常胚体的产量。Salm等（1996）报告了月季黄金大道（Money Way）体细胞胚体的形成和幼芽再生，培养基用的是无激素的SH（Schenk and Hildebrand 1972）培养基外加500毫克/ 升水解态的酪蛋白、87毫克/升蔗糖、1000毫克/升肌醇、100毫克/升脯氨酸、5毫克/升烟酸、0.5毫克/升吡哆盐酸，5毫克/升硫胺盐酸。 999苗木网,www.999miaomu.com

在加有2.2微摩尔/升BA，0.05微摩尔/升NAA，0.05微摩尔/升GA3 的培养基每4周一个间隔对胚体形成的愈伤组织团进行再培养，能诱导出体细胞胚体次生物，且能长期保持（16个月），在培养基中加入2， 4-D有助于愈伤组织长期保存。Kunitake等注意到受精的胚有能力使体细胞胚体在没有外源生长调节剂的培养基上正常发育，但这个胚体形成在6个月以后不再持续。Rout等在兰道尔的愈伤组织培养中报告了体细胞胚体形成和再生的发育顺序。

胚的发育和体细胞胚体的萌芽是形成植株的前提。关于月季栽培品种有许多报告表明，省略或降低培养基中2，4-D的浓度有利于胚的发育和萌芽。Mathews等（1991）报告在杂种月季中有30%的体细胞胚体在转到无激素的SH培养基上后，能萌芽形成新的植株。Noriega和S ondahl（1991）及Roberts等（1990）报告在培养基中加入ABA和GA3 有助于胚的发育。Rount等（1991）报告在初培养时加入脯氨酸，利用它在再生培养基中的排斥作用，可刺激胚发育，降低发育异常的频率。他们还报告在1/2MS培养基上外加0.5毫克/升BA，0.1摩尔/升GA3和1. 5毫克/升硫酸腺嘌呤，在8℃下培养4天能使萌芽率从0提高到12%。Ro berts等（1995）报告在4℃以下培养2周，能使萌芽率从12%提高到24 %。Kunitake等（1993）报告在含有0.1摩尔/升山梨糖醇而没有生长调节剂的培养基上，用玫瑰的体细胞胚芽形成了新的植株。

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八、炼苗和大田移栽

九、离体培养中无性系的稳定性

十、遗传物质的转化

十一、结论

本文总结了月季生物技术方面的研究进展。影响月季扩繁的因素很多，无论直接用没有形成愈伤组织的外植体还是间接地用有生长潜能的外植体，都能使不同种或品种的月季离体的不定幼芽再生。体细胞胚体的形成给体细胞杂交、冷冻保存和基因转化的研究提供了条件。植物细胞基因控制方面的最新进展为月季的研究打开了新的思路。把外源基因转移到植物体中主要依靠离体再生系统的再生效率。基因转化可以通过许多方法实现，包括通过显微注射把DNA直接插进原生质体。但最重要的突破是基因枪的出现。基因枪是通过表面涂有DNA的钨或金的微粒轰击再生组织。在转基因月季发育的早期可以用DAN随机扩增多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、限制酶片段长度多态性（RFLP）等分子标记的方法进行检测，以观测遗传物质的变化。研究人员Marchant等（1998a）用遗传转化技术使转基因月季的再生获得成功。Marchant等（1998b）报告几丁质转基因在控制月季黑斑病方面的表达，他们表示抗病基因转入月季能提高观赏植物的价值。

离体培养技术和其他生物技术在提高月季抗病虫性、花色、形态和瓶插寿命方面有重要作用。单倍体离体培养将有助于产生纯合体，胚培养有助于多种月季的杂交，提高产量和繁殖系数。这些技术有助于我们认识月季基本的遗传物质。另外，把月季作用木本植物生物技术的模式物种，在研究染色体倍性方面有重要作用，因为月季核DNA数量少，完成开花的周期短，种子产量高，有大量的可供利用的栽培品种。

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