植物组培原理以及实施步骤

植物组织培养

一、原理

植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织(器官或细胞)分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。 999苗木网,999miaomu.com

愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。

二、试剂及仪器 999中国苗木网,www.999miaomu.com

(一)仪器设备 中国苗木网,www.999miaomu.com

超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器(1-5ml)、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶(500ml、100ml)、量筒、烧杯(1000ml)、试剂瓶(1000ml、100ml)、长镊子、记号笔(或标签纸)、培养皿、酒精灯、打孔器

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(二)试剂

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75%酒精、次氯酸钠(或H2O2)、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、烟酸、盐酸-硫胺素(VB1)、盐酸-吡哆醇(VB6)、肌醇、甘氨酸

三、实验步骤 苗木网,999miaomu.com

(一)培养基配制

1.培养基的选择 999苗木网,www.999miaomu.com

植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。 999苗木网,999miaomu.com

无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、NOA(萘氧乙酸)、P-CPA(对氯苯氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)、2，4，5-T(三氯苯氧乙酸);BAP(苄氨基嘌呤)、6-BA(苄基腺嘌呤)、2-Zi(异戊烯氨基嘌呤)、KT(激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。 999中国苗木网,999miaomu.com

培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基种类繁多，最基本、最常用的培养基为MS培养基(见表1)。

2.培养基的配制

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①先按表1配制MS培养基贮液，②再将贮液与其他成分按比例混合。③此外还需加入适量的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉，适量的生长调节剂等。④将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤再用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调节培养基的pH值至最适。⑥分装至三角烧瓶，封口膜封口，等待灭菌后使用。

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3.几种诱导愈伤组织的培养基

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胡萝卜MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA 苗木网,www.999miaomu.com

玫瑰叶盘，芽MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA 苗木网,999miaomu.com

烟草叶盘、叶柄MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA 中国苗木网,999miaomu.com

pH5.8，蔗糖30%，琼脂粉6.5g/L。 999苗木网,999miaomu.com

(二)灭菌 中国苗木网,999miaomu.com

1.培养基及器具灭菌

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培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化(见表2)灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出已灭菌的培养基。

可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。 999中国苗木网,www.999miaomu.com

2.工作环境灭菌

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接种前1h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。 中国苗木网,999miaomu.com

3.植物材料的灭菌

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植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒;组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。

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