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蓝莓组培技术

来源：作者：发布时间：2013-07-23 17:14

　　一、实验室设计
　　1.洗涤室：器具的洗涤、干燥
　　2.配置室：进行药品的保存、配置、消毒、分装等。
　　3.灭菌室：对培养进行高温高压灭菌，有时候也会把培养基的熬制、分装放在此房间。
　　4.接种室：进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
　　5.培养室：植物材料的无菌培养，室内主要有培养架和控制温度及光照的设备。
　　其他配套：大型组培室，包括工厂化组培车间还好专门配套仓库、更衣室和办公室等，有的还要配备细胞学观察实验室，进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等。
　　二、常用设备和器材
　　1.高压蒸气灭菌锅：用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
　　2.超菌工作台：用于培养物的无菌操作。（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）
　　3.接种工具：包括镊子、剪刀、解剖刀、洒精灯、接种器械灭菌器等。
　　4.培养设备：包括空调机、定时器、温度控制器、增湿机或去湿机、培养架、光照培养箱等。
　　5.配置设备：包括天平、酸度计、磁力搅拌器、蒸馏水器、烘箱或玻璃仪器烘干器、电炉、药品柜、冰箱或冷柜、晾瓶架等。
　　在这些仪器设备中，高压灭菌锅、超净工作台、电子天秤、培养架、冰箱、接种工具等是组培必备的，也是每天都要用到的，因此质量要可靠。 999苗木网,www.999miaomu.com
　　三、玻璃器皿的选择和清洗
　　1.玻璃器皿的选择
　　*试管-适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。
　　*三角锥瓶-适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。
　　*L形管和T形管-为专用的旋转式液体培养试管。
　　*培养皿-适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。
　　*角形培养瓶和圆形培养瓶-适用于液体培养用，如单细胞和原生质体的浅层培养。
　　*组培瓶/果酱瓶-常用作试管苗大量繁殖用的培养瓶。
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　　2.玻璃器皿的清洗
　　（1）清洗玻璃器皿用的洗涤剂有肥皂、洗洁精、洗衣粉、和铬酸钾洗涤液。
　　（2）清洗时先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用热的肥皂水或洗洁精洗净，清水冲洗干净后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
　　（3）洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。
　　四、影响蓝莓组培的因素
　　1.树种因素：(1)基因型，(2)植株年龄，(3)组织和器官的年龄，(4)植株的生理状态，(5)取材年份及生长条件，(6)取材部位及大小。
　　2.培养基因素：无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、PH值、渗透压、活性炭。蓝莓组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成份等直接影响培养材料的生长发育。故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。

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　　3.外植体的选择和灭菌：不同品种、不同器官之间的分化能力有差别，且组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此在进行蓝莓组织培养时，必须选择合适的外植体进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。
　　4.环境因素：(1)光照：包括光强、光质、光周期，(2)温度，(3)湿度，(4)气体。
　　五、蓝莓培养基的主要成分
　　（一）、基本培养基的主要成分：
　　1.无机盐：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素：Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水：培养基95%是水，应使用蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,水应放在塑料容器中。
　　2.有机化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)维生素类：有维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等，(3)氨基酸类(有机氮源)。
　　3.植物激素（生长调节物质）：
　　（1）生长素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；作用的强弱顺序为：2，4-D>NAA>IBA>IAA。
　　（2）细胞分裂素：天然：6-BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）；人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-异戊烯酰嘌呤）；它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显着改变其他的激素作用；作用的强弱顺序为：TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。

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　　（3）赤霉素：GA3。
　　（4）乙烯及乙烯抑制剂。
　　4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。
　　5.琼脂（是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物），其主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢。
　　6.活性炭：加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
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　　(二)、蓝莓培养基：上面提到这些物质是组培过程经常用到，具体到蓝莓，一般用WPM培养基作为基本培养基，激素多用KT、6-BA，天然提取物和活性炭一般不用。
　　六、蓝莓外植体的选择和灭菌
　　（一）、外植体的选择：以春季初发的嫩梢最为合适，取材时间要在晴天下午取材，取材部位以靠近木本的下部内堂枝为好。
　　(二)、外植体的灭菌方法
　　1、常用灭菌药剂的使用和效果：
　　消毒剂使用浓度/%清除难易消毒时间/min灭菌效果
　　次氯酸钠2易5-30很好
　　次氯酸钙9-10易5-30很好
　　漂白粉饱和溶液易5-30很好
　　升汞0.1-1较难2-10最好
　　酒精70-75易0.2-2好
　　过氧化氢10-12最易5-15好 999中国苗木网,www.999miaomu.com
　　溴水1-2易2-10很好
　　硝酸银1较难5-30好
　　抗菌素4-50mg/L中30-60较好
　　对于蓝莓而言，一般先用75%酒精处理10-30苗，再用升汞处理5-10分钟，根据材料的老嫩程度、外界环境不同而选择适当的处理时间，一般是从低到高作实验摸索最佳的处理时间。
　　2.灭菌方法：
　　(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗、水流冲刷4小时左右---75%酒精浸泡10-30秒---无菌水洗1-2次---升汞溶液泡5-10min---无菌水洗7-10次
　　七、外植体接种和培养
　　1.外植体的接种
　　（1）接种室的消毒：用70%酒精喷雾使细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降,再用紫外灯照射20min；并且每月用高锰酸钾与甲醛蒸气熏蒸一次。超净工作台可用新吉尔灭或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要经严格的灭菌才能带进接种室。
　　（2）接种：左手拿培养瓶，右手拿接种工具接种，瓶口要靠近酒精灯火焰、接种动作要快，以免造成污染。
　　2.培养方法
　　（1）根据外植体不同可分为：胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养。蓝莓常用的是器官培养或组织培养。
　　（2）根据培养方式不同可分为：固体培养、液体培养、半固体培养、双层培养。具体到蓝莓，一般都是固体培养，即用琼脂作为支持物，在固体培养基上培养蓝莓组培苗。

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　　3.培养条件：指温度、湿度、光照、PH值、氧和其它气体等。蓝莓一般在25度左右进行光照培养，光强一般为3000-5000Lux，培养间湿度不宜过高，要控制是60%以下。经过三十多天的培养，就可进行分苗了。
　　八、组培苗生根和驯化
　　增值的蓝莓苗达到所需的规模后，即可进行生根处理了。蓝莓一般采取瓶外生根技术，即在温室内进行扦插生根，此种方法可以大量节省组培室的投资规模和生产成本。

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