组织培养中的清洗、消毒灭菌技术 |
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来源: 作者: 发布时间:2013-07-20 16:09 |
999苗木网,www.999miaomu.com 1、清洗植物组织培养用的各种玻璃器皿,特别是培养瓶和盛培养基的器皿,一定要严格清洗,以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内,影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗,先将污物如培养基、培养物倒掉,再浸入水中,然后洗涤。玻璃器皿的洗涤,可根据器皿的污染程度和性质,采用不同的方法,通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿,必须先进行高压消毒和煮沸,以杀死菌体,否则会产生孢子飞扬,污染环境,给组织培养带来严重困难。器皿洗净后,应烘干或晾干,放在规定的地方,便于取用。 999中国苗木网,www.999miaomu.com 灼烧灭菌(用于无菌操作的器械)o在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。 干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽抱的抗热水平,通常采用170℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。 过滤灭菌(不耐热的物质)一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。可用无菌的孔径0.20-0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。 苗木网,www.999miaomu.com 紫外线和熏蒸灭菌(空间)o(1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。紫外线的波长为200-300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按5-8ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。 喷雾灭菌(物体表面)物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精反复涂擦灭菌,l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以。 999苗木网,www.999miaomu.com 3、无菌操作 植物组织培养是一种无菌技术,因此不仅要求整个操作过程,一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌,而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程,如少有疏忽,都会造成无法挽回的后果,使工作前功尽弃。工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点: a.入无菌室前,要洗手,去掉指甲中的污物。 b.入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 c.操作前要用70的酒精擦洗工作人员的手,操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话,亦不准对着操作区呼吸,以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 d.必须在酒精灯火焰处进行操作,如打开瓶口,转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下,再将盖子也在火焰上烧一下,然后盖上。 999中国苗木网,www.999miaomu.com |
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